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依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶基因多态性与帕金森病遗传易患性的关系

2002-9-18 16:30| 发布者: admin| 查看: 2966| 评论: 0|原作者: 邵明|来自: 中华神经科杂志 1999年第1期第32卷 论著

摘要: 【摘要】 目的 探讨依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶基因cDNA609位碱基C→T点突变所致的基因多态性是否与帕金森病遗传易患性有关。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法分析了126例帕金 ...

依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶基因多态性与帕金森病遗传易患性的关系

邵明 刘焯霖 陶恩祥 潘锡榜 陈彪
510080 广州,中山医科大学神经病学教研室[邵明(现在第一军医大学附属珠江医院神经内科)、刘焯霖、陶恩祥、潘锡榜];美国帕金森病研究所(陈彪)

关键词: 帕金森病;NAD(P)H脱氢酶(醌);基因;多态性(遗传学)

  【摘要】 目的 探讨依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶基因cDNA609位碱基C→T点突变所致的基因多态性是否与帕金森病遗传易患性有关。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法分析了126例帕金森病(PD)病人与136名健康成人对照组NQO1的基因多态性。结果 PD组的T等位基因频率为52%,而对照组为43%,两组差异有显著意义(P<0.05)。基因型分布在PD和对照组之间差异有显著意义(P<0.05),带T等位基因的个体患PD的风险增加3.8倍。结论 本研究结果提示NQO1基因cDNA609突变T等位基因可能是PD发生的危险性因素,与PD的遗传易患性有关。

Association between the genetic polymorphism of NAD(P)H: quinone oxidoreductase gene and susceptibility of Parkinson disease SHAO Ming*, LIU Zhuolin, TAO Enxiang, et al. *Department of Neurology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
  【Abstract】 Objectives To investigate whether Parkinson's disease (PD) is associated with genetic polymorphisms of NQO1 gene caused by the point mutation of cDNA609 C to T. Methods The polymorphism of NQO1 gene was analyzed in 126 patients with PD and 136 unrelated healthy adult individuals with polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Results In this study, the frequencies of T allele were 52 % and 43% in the PD ground and the health control group respectively, which was significantly different between the two groups. The allelic frequency of the mutant T allele was significantly higher in the PD patients as compared to the controls(P<0.05). There was a significant difference in the overall genotypical distribution between the patients and the controls (P< 0.05). The risk of suffering from PD was increased 3.8 times in the individuals with T allelic genotype of NQO1 gene. Conclusion This study suggested that the cDNA 609 T allele of NQO1 gene might be the risk factor of PD, which could be associated with the genetic susceptibility of PD.
  【Key word】 Parkinson disease   NAD(P)H dehydrogenase (quinone)  Genes  Polymorphism(genetics)

  帕金森病(PD)是一种常见的神经系统变性疾病,该病的主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的消失,其原因至今仍不清楚。由于多巴胺自动氧化时产生的醌、半醌和氧自由基可以损伤黑质神经元[1-3],因此,多巴胺可能作为内源性毒素参与PD的发病。依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶(NQO1)是一种黄素酶,它催化醌双电子还原反应,从而减少氧自由基的产生[4]。有研究发现NQO1可能有抗氧化效应,对多巴胺神经元起保护作用[5],该酶的活性高低可能与多巴胺自动氧化时氧自由基的产生的量有关。最近的研究发现NQO1基因cDNA序列的609位点的C→T的错义突变可导致该酶的活性缺乏[6]。本研究旨在探讨NQO1基因的该点突变与PD的遗传易患性的关系。

对象和方法
  1.研究对象:经中山医科大学第一附属医院神经科门诊诊断的126例帕金森病人,年龄46~73岁,其中男74例,女52例;136名健康成人,其中男66名,女70名,分别来自门诊健康查体,年龄40~72岁。
  2.研究方法:抽静脉血10 mL提取DNA,利用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术,采用陈彪等[7,8]报道的方法。其引物序列如下:NQO1 F:5′-AAGCCCAGACCAACTTCT-3、NQO1 R:5′-GCGTTTCTTCCATCCTTC-3。PCR扩增是用Pekin-Elemer P600仪,扩增DNA长度为195 bp。将扩增产物10 μl用20单位HinfⅠ限制性内切酶在37℃下消化2小时,最后以8%的聚丙酰胺凝胶电泳及EB染色。若NQO1 C609→T碱基替换时,则产生一个Hinf I酶切位点。扩增的片段被切成119 bp和76 bp两个片段。当基因型为野生型时(C/C),则不能被消化,为195 bp;如基因型为杂合子(C/T)时则为195、119、76 bp等三个片段;基因型为突变型(T/T)时,则为119、76bp两个片段[8]
  3.统计方法:组间基因频率和基因型频率差异的检测采用χ2检验,用SPSS统计软件包分析。

结果
  1.PD组与对照组NQO1 C609区位→T点多态性频率及基因型多态性分布比较:本研究发现在PD组中NQO1基因T等位基因的频率为52%,而对照组为43%,较对照组显著增高(χ2=4.602,P 值=0.032)。NQO1各基因型频率在正常组分别为:野生型(C/C)为30%、杂合型(C/T)为54%、突变纯合子型(T/T)为16%,其基因 型分布符合迪-温伯格平衡。在PD组分别为:野生型(C/C)为10%、杂合型(C/T)为75%、突变纯合子型(T/T)为15%。其基因型分布不符合 哈迪-温伯格平衡。NQO1基因型的分布频率在PD组和对照组相差显著,C/T基因型的频率在PD组中明显高于对照组(P<0.05)。T等位基因 携带者患PD的危险性是C等位基因的1.5倍(95%可信限:1.033~2.057),见表1。

1 PD组和对照组基因型及等位基因分布比较

组别

不同等位基因
染色体数(%)

不同基因型
例数(%)

C

T

C/C

C/T

T/T

PD

120(48)

132(52)

13(10)

94(75)

19(15)

对照组

155(57)

117(43)

41(30)

73(54)

22(16)

  2.PD组与对照组NQO1 C/C基因型与C/T+T/T基因型的比较:将带有T突变的NQO1基因型合并,视为PD的危险因素。PD组带有T突变的NQO1基因型的个体频率为90%,而对照组为70%,PD组显著高于对照组,两组相差显著(χ2=15.717,P<0.0001)。带T突变等位基因的基因型患者患PD的危险性是NQO1C/C基因型的3.8倍(95%可信限:1.8997.411)。

讨论
  一、多巴胺的自动氧化与PD的关系
  许多研究表明遗传因素和环境因素均与帕金森病的发病有关,但任何单一因素均不能完全解释PD的发病模式和病因。PD的遗传易患性的假说认为只有在具有 特定的遗传缺陷的个体同时又经常暴露于某些环境毒素时,才可能导致PD的发生。对遗传易患性基因的筛选主要集中在外源性解毒酶,如细胞色素P450系统和 谷胱甘肽转移酶的基因,并发现细胞色素P4502D6(CYP2D6) 基因的突变与PD有关。但外源性毒素与遗传易患性结合并不能完全解释PD的病因,由于选择性的黑质多巴胺能神经元变性是PD的病理核心,故人们一直怀疑多 巴胺的代谢参与了PD的发病。研究发现多巴胺的自动氧化代谢与氧自由基的生成和氧化应激反应密切相关,多巴胺在生理pH的条件下,可自动氧化形成胺色素[1-3]。 在胺色素的进一步降解过程中,细胞色素P450还原酶和NQO1酶起着重要作用。细胞色素P450还原酶以单电子的方式催化胺色素还原为半醌。由于半醌不 稳定,可再自动氧化形成胺色素。此过程伴随产生超氧阴离子和过氧化氢,后者在有铁离子存在的情况下,形成毒性更高的活性氧和羟自由基,同时使还原性辅酶 I(NADPH)在胺色素和半醌之间的氧化还原反应中大量消耗[5]。NADPH是谷胱甘肽还原酶的底物,在保持谷光甘肽的还原态 中有重要作用;而还原态的谷胱甘肽是胞浆中清除过氧化氢最主要的物质。因此,多巴胺自动氧化的中间产物经细胞色素P450酶降解可产生大量对神经元有害活 性氧和羟自由基。而胺色素在NQO1的催化下,可以双电子的方式还原,直接生产氢醌,转化为水溶性的化合物排出体外,该过程无半醌生成,因此NQO1能对 抗活性氧的形成,具有抗氧化和保护作用。已有研究证实在多巴胺神经元内NQO1与细胞色素P450酶共存[9,10],且体内存在多巴胺的自动氧化,不过正常生理条件下,自动氧化过程进行得很慢,并且在中枢包括黑质,有大量的NQO1存在,能保证神经元免受多巴胺自动氧化的损害[9]。但如果上述环节有缺陷,如NQO1的活性低下,就有可能使黑质多巴胺能神经元对多巴胺的自动氧化敏感而受到损害。
  二、NQO1基因多态性与及PD的关系
  NQO1酶的活性在人群中的分布的确存在个体差异,国外报道在正常人群中有4%~10%的人缺乏NQO1的活性,11%的人该酶的活性为中等水平[11,12]。Traver等[6,13]发 现NQO1cDNA序列609位点存在一个C→T的错义突变,该突变导致NQO1基因编码的187位氨基酸由脯氨酸变成了色氨酸,虽不影响其mRNA的合 成,但可能改变了酶的二级结构,使酶的活性缺乏或降低。进一步的研究发现在正常人群中均有该突变位点等位基因的纯合子和杂合子存在[14],说明NQO1基因在该位点具有多态性。本研究利用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术,测定了126例帕金森病人和136名正常对照组的NQO1的C609→T基因频率。结果发现PD组NQO1基因T等位基因频率高于对照组,带T等位基因的个体患PD的危险性是C等位基因的1.5倍。而携带有突变T等位基因的个体(C/T和T/T基因型)患PD的危险性是不带突变T等位基因个体的3.8倍。该结果提示NQO1基因cDNA609T等位基因可能是帕金森病发病的危险性因素之一,其原因可能是带有NQO1cDNA609T 等位基因的个体,其NQO1酶的活性低下或缺乏,使黑质多巴胺的自动氧化过程的自由基不能被清除以及NADPH的消耗增多,最终使神经元胞浆内过氧化氢增 多,造成神经元变性死亡。同时,本研究的结果还显示,有70%的正常人NQO1基因带有T突变的等位基因,但却未发病,这说明该因素并不是唯一的危险因 素,它可能和个体的其他遗传缺陷,如外源性解毒酶CYP2D6基因的多态性以及参与多巴胺代谢的其他酶,如儿茶酚胺-O-甲位转移酶基因和单胺氧化酶-B 基因的多态性,共同构成PD的遗传易患性。

参考文献
 1 Graham DG. Oxidative pathways for catecholamines in the genesis of neuromelanin and cytotoxic quinones. Mol Pharmacol, 1978, 14: 633-643.
 2 Kalyanaraman B, Felix C, Sealy RC. Electron spin resonance-spin stabilization of semiquinones produced during oxidation of epinephrine and its analogues. J Biol chem, 1984, 259:354-358.
 3 Hawley MD, Tarawawidi SV, Piekarski S, et al. Electrochemical studies of the oxidation pathway of catecholamine. J Am Chem Soc, 1967,89:447-450.
 4 Ernster L. DT-diaphorase. Meth Enzymol, 1967,10:309-319.
 5 Baez S, Linderson Y, Segura Aguilar JS. Superoxide dismutase and Catalase enhance autoxidation during one-electron reduction of aminochrome by NADPH-cytochrome P-450 reductase. Biochem Mol Med, 1995,54:12-18.
 6 Traver RD, Horikoshi T, Danenberg KD,et al. NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene expression in human colon carcinoma cells: characterization of a mutation which modulates DT-diaphorase activity and mitomycin sensitivity. Cancer Res. 1992, 52: 797-802.
 7 Chan P. Identification of an NAD(P)H:quinone oxidoreductase polymorphism and its association with Parkinson's disease. Mov Dis, 1997,12(Suppl):26.
 8 邵明,刘焯霖,陶恩祥,等. 中国汉族依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶基因多态性。中山医科大学学报, 1998,19:23-26.
 9 Schultzberg M, Segura-Aguilar J, Lind C. Distribution of DT-diaphorase in the rat brain : Biochemical and immunohistochemical studies. Neuroscience 1988,27:763-776.
10 Haglund JA,Koheler C, Haaparanta T,et al. Presence of NADPH-cytochromme P-450 reductase in central catecholaminergic neurones. Nature ,1984,307:259-262.
11 Edwards Y, Potter J, Hopkinson DA. Human FAD-dependent NAD(P)H diaphorase. Biochem J ,1980,429-436.
12 Eickelmann P, Ebert T, Warskulat U, et al. Expression of NAD(P)H:quinone oxidoreductase and glutathione S-transferases alpha and pi in human renal cell carcinoma and in kidney cancer-derived cell lines. Carcinogenesis, 1994 , 15: 219-225.
13 Kolesar JM, KUhn JG. Detection of a point mutation in NQO1(DT-diaphorase) in a pation with Colon cancer. J Natl Cancer Inst, 1995,87:1022-1024.
14 Kuehl BL, Paterson JW, Peacock JW. Presence of a heterozygous substitution and its relationship to DT-diaphorase activity.Br J Cancer, 1995, 72: 555-561.

(收稿:1998-06-30  修回:1998-12-19

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